Что такое технология crispr для школьников
CRISPR «для чайников»: краткий путеводитель по главной биотехнологии
CRISPR — одна из самых перспективных технологий последних лет, и в ближайшие годы ее роль будет только расти. Однако далеко не все понимают, как именно работает генное редактирование. Издание Vox представило простой справочник, который поможет разобраться в CRISPR даже человеку, далекому от биологии.
Говоря вкратце, CRISPR — точнее, CRISPR/Cas9 — мощный инструмент редактирования геномов. Он основан на элементе защитной системы бактерий, который биологи приспособили для внесения изменений в ДНК растений, животных и даже людей. Технология позволяет внести поправки всего за несколько дней, а не недель или месяцев. Никогда прежде у человечества не было столь точного орудия для манипуляции генами.
История CRISPR началась в 1987 году, когда японские ученые, изучавшие кишечную палочку Escherichia coli, обнаружили в ее ДНК необычные повторяющиеся последовательности. Их биологическое значение выяснить не удалось, однако вскоре аналогичные фрагменты были найдены в геноме других бактерий и архей. Последовательности получили название CRISPR — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats).
Дело в том, что бактерии постоянно должны отражать атаки вирусов — своих естественных врагов. Для этого они производят специальные ферменты. Каждый раз, когда бактерии удается убить вирус, она разрезает остатки его генетического материала и сохраняет их внутри последовательностей CRISPR. Затем эта информация используется в случае новой вирусной атаки. При нападении бактерия производит белки Cas9, которые несут фрагмент генетического материала вируса. Если этот участок и ДНК атакующего вируса совпадают, Cas9 разрезает генетический материал последнего и нейтрализует угрозу.
Некоторое время это открытие было интересно только микробиологам. Однако все изменилось в 2011 году, когда биологи Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье решили точнее изучить механизм CRISPR. Они обнаружили, что белок Cas9 можно обмануть, дав ему искусственную РНК. Белок, несущий такую РНК, будет искать генетические фрагменты, совпадающие с тем, что он несет на себе. Обнаружив соответствие с чужой ДНК, он начнет измельчать ее, независимо от того, кому она принадлежит — вирусу, растению или животному. Как отметили в статье 2012 года Дудна и Шарпантье, этот механизм можно использовать для разрезания любого генома в нужном месте.
В феврале 2013 года было доказано, что CRISPR/Cas9 можно использовать для редактирования ДНК в культуре клеток мышей и человека. Более того. выяснилось, что технология позволяет не только удалять ненужные гены, но и вставлять на их место другие. Для этого достаточно добавить ферменты, восстанавливающие ДНК.
Помимо прочего, в них описывались аналоги белков Cas9. Например, Cas13 может редактировать не ДНК, а РНК.
Идея генной модификации не нова, и различные ее методики существуют уже много лет. Однако CRISPR превосходит все известные до сих пор технологии благодаря доступности и точности. Редактирование одного гена обойдется всего в $75 и займет несколько часов. И, что немаловажно, технология работает с любым организмом на Земле.
Существует почти бесконечное множество потенциальных применений технологии. Во-первых, CRISPR позволяет ученым выяснить функцию различных генов. Достаточно просто вырезать изучаемый ген из ДНК и увидеть, какие функции организма оказались затронуты. Однако общественность намного сильнее интересуют практические применения. Их можно разделить на несколько пунктов:
1) Изменения в сельском хозяйстве
CRISPR позволяет сделать сельскохозяйственные культуры более питательными, более вкусными и устойчивыми к жаре и стрессу. Можно придать растениям и другие свойства: например, вырезать из арахиса ген аллергена, а в бананы внедрить устойчивость к смертельному грибку. Технологию можно применить и для редактирования генома домашних животных — например, коров.
2) Борьба с наследственными заболеваниями
Ученые намерены использовать CRISPR, чтобы вырезать из человеческого генома мутации, ответственные за целый ряд заболеваний, например, серповидноклеточную анемию. Технология также позволят вырезать гены хореи Хантингтона или мутаций BRCA-1 и 2, связанных с раком молочной железы и яичников. Теоретически CRISPR-атака даже может остановить развитие ВИЧ.
3) Новые антибиотики и противовирусные препараты
Бактерии развивают устойчивость к антибиотикам, а разрабатывать новые дорого и сложно. Технология CRISPR дает возможность с высокой точностью уничтожать опредленные виды бактерий, хотя конкретную методику еще предстоит разработать. Ряд исследователей также работает над CRISPR-системами, нацеленными на вирусы.
4) Генетический драйв
С помощью CRISPR можно изменить не просто геном отдельного животного и растения, но и генофонд целого вида. Эта концепция известна как «генетический драйв». Обычно любой организм передает потомству половину своих генов. Однако использование CRISPR позволяет повысить вероятность передачи генов по наследству почти до 100%. Это позволит нужному признаку быстро распространиться по всей популяции.
В более щадящем варианте можно сделать комаров устойчивыми к заражению малярийным плазмодием. Они не смогут передавать паразита людям, и малярии будет положен конец . Однако для осуществления таких проектов нужно преодолеть сомнения скептиков, которые протестуют против столь масштабного вторжения в природу.
5) Создание «дизайнерских младенцев»
Этот пункт привлекает больше всего общественного внимания. Однако, по словам ученых, пока наши технологические возможности не позволяют создавать детей с заданными качествами. Например, за уровень интеллекта отвечают тысячи генов, и скорректировать их всех пока невозможно. Возможно, в будущем технологии достигнут нужного уровня, но пока беспокоиться не о чем.
Не все ученые считают CRISPR безопасной технологией. Например, согласно недавним исследованиям, генное редактирование может вызвать обширные нецелевые мутации. Авторы другой работы отмечают, что CRISPR ошибается в 15% случаев.
CRISPR, дешевый и быстрый: революция в генной инженерии Understand article
Права на изображение
принадлежат Nicola Graf
Вы печатаете предложение и понимаете, что опечатались в одной букве. Ошибка изменит смысл всего предложения, поэтому вы наводите курсор на неправильную букву, нажимаете «Backspace» и печатаете правильный символ. Это исключительно лёгкое задание. Удивительно, но теперь этот подход воспроизвели и в лабораториях, с учёными в роли писателей и ДНК в качестве сообщения, которое нужно исправить.
Это стало реальным благодаря CRISPR-Cas9 – новой технологии, совершенно покорившей научное сообщество за последние несколько лет. Помимо многообещающих биомедицинских достижений, она предоставила и новые непростые задачи. В самом деле, эта противоречивая методика породила столько шума в медиа пространстве, что вскоре и школьные учителя биологии услышат от своих учеников вопросы о CRISPR-Cas9. В этой статье мы предлагаем краткий обзор того, что такое технология CRISPR-Cas9 и почему она так важна.
Что такое CRISPR-Cas9?
CRISPR-Cas9 – это система, используемая бактериями для защиты от нападения вирусов, но недавно её удалось приспособить для редактирования генома в определённых позициях. Система состоит из двух компонентов: CRISPR и Cas9. CRISPR – аббревиатура, обозначающая «короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами» – это набор позиций в геноме, где находятся повторяющиеся участки ДНК. Рядом с этими повторами расположены гены Cas, кодирующие важные ферменты, один из которых – Cas9 – способен разрезать нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК).
Когда бактерию атакует вирус, он вводит в неё свои нуклеиновые кислоты, на что бактерия реагирует путём синтеза ферментов Cas, чтобы вырезать куски вирусных нуклеиновых кислот и записать в свою ДНК в CRISPR позициях (изображение 1). Таким образом бактерии приобретают полезный иммунитет: в следующий раз, когда её атакует тот же вид вируса, участки CRISPR вместе с вирусными нуклеиновыми кислотами будут скопированы в короткие молекулы РНК. Эти молекулы прикрепятся к ферментам Cas9 и направят получившийся комплекс к ДНК или РНК нападающего, стремясь к комплементарной последовательности. Затем Cas9 разрежет чужую цепочку нуклеиновых кислот, лишая вирус возможности захватить бактерию для самовоспроизведения.
Изображение 1: CRISPR-Cas9: бактериальный механизм защиты. А: Фермент Cas9
1. Вирус вторгается в бактериальную клетку; 2. Нуклеиновые кислоты вируса записываются в CRISPR участке; 3. Формирование CRISPR РНК; 4. CRISPR РНК прикрепляется к ферменту Cas9; 5. CRISPR РНК направляет фермент Cas9 к вирусу. Он разрезает и уничтожает вирусный геном.
Права на изображение принадлежат Nicola Graf
/>Изображение 2:
Редактирование генов при
помощи CRISPR-Cas9. А:
Заданная
последовательность; B: ДНК;
C: Направляющая РНК; D:
Cas9; E: Новая цепочка ДНК
1. Направляющая РНК
прикрепляется к заданной
последовательности ДНК;
2. Фермент Cas9 связывается
с направляющей цепочкой
РНК; 3. Фермент Cas9
разрезает обе цепи ДНК;
4. Бактериальная система
репарации вставляет новый
участок ДНК на месте
разрыва взамен исходного.
Права на изображение
принадлежат Nicola Graf
Как же удалось адаптировать бактериальную систему для использования в генной инженерии? В 2012 году команды Дженнифер Дудны в университете Калифорнии в Беркли (США) и Эммануэль Шарпентье в университете Умео (Швеция) модифицировали и сложили вместе короткие молекулы РНК, чтобы получить единую «направляющую» РНК (изображение 2). Она должна иметь конец, который может крепиться к Cas9, но оставшаяся последовательность может быть подобрана в пару к любой последовательности ДНК. Благодаря такому многообразию возможностей, CRISPR-Cas9 может вырезать конкретные заданные участки ДНК. Вскоре после этого лаборатория Фэна Чжана в Массачусетском технологическом институте (США) пошла ещё дальше, показав, что комплексы CRISPR-Cas9 способны создавать точные разрезы ДНК в человеческих и мышиных клетках (Cong et al, 2013). Кроме того, они подправили Cas9, чтобы он мог резать ДНК немного по-другому, стимулируя определенный механизм починки ДНК в клетке. Таким способом ученым удалось успешно вставить новую последовательность нуклеотидов точно на место разреза, заменив исходную (изображение 2).
Благодаря этим инновационным открытиям, CRISPR-Cas9 система была превращена из узкоспециализированного раздела микробиологии в перспективный исследовательский инструмент, позволяющий ученым легко и с высокой точностью редактировать гены для различных целей.
Зачем это нужно?
Для изучения функции генов ученые часто пытаются вывести клеточные линии или модельные организмы, в которых исследуемый ген содержит мутацию или полностью деактивирован (приём, известный как нокаут гена). CRISPR-Cas9 предоставляет быстрый и точный способ достичь этой цели. К тому же, фермент Cas9 можно изменить так, чтобы он больше не мог резать ДНК, но был способен прикрепляться к определенным последовательностям ДНК при помощи направляющей цепочки РНК. Таким образом, РНК полимераза физически не сможет прикрепиться к этому участку, что позволяет исследователям контролировать транскрипцию определенных генов – начальную точку активности гена.
Помимо упомянутых важных применений в биомедицинских исследованиях, CRISPR-Cas9 также предлагает более прямые приложения в медицине. Ученые уже пробовали использовать редактирование генома при помощи CRISPR-Cas9 для вырезания нуклеотидных последовательностей ВИЧ и предотвращения репликации этого вируса в человеческих клеточных линиях. Его также применяли для удаления мутированных последовательностей в мышах с мышечной дистрофией Дюшенна, которая вызывает мышечную слабость, что дает надежду на успешную терапию пациентам и семьям, страдающим этим и другими похожими генетическими заболеваниями. Недавно были предприняты попытки радикального редактирования генома свиных эмбрионов при помощи CRISPR-Cas9 в надежде создать способ безопасно получать органы для трансплантации человеку.
А если ученые уже модифицируют эмбрионы свиней, можно ли редактировать геном и в человеческих эмбрионах? Именно это пытались делать китайские ученые в 2015 году, используя CRISPR-Cas9 для изменения гена бета-талассемии в 86 человеческих эмбрионах (Cyranoski & Reardon, 2015). Оказалось, что эта методика пока что довольно неэффективна, так как изменить последовательность ДНК удалось менее чем в четверти эмбрионов. Тем не менее, новость об этом открытии вызывала немало разногласий касаемо этичности подобных исследований.
Вопросы этики – и будущее
Этические опасения относились не только к экспериментам на эмбрионах, но и к весьма непростой перспективе генной инженерии человека. Благодаря CRISPR-Cas9, появилась теоретическая возможность вносить генные изменения в половые клетки (сперматозоиды и яйцеклетки), которые будут могут быть переданы будущим поколениям. Помимо воодушевляющего потенциала избавить человечество от генетических болезней, эта идея поднимает и вопрос того, какие именно изменения должны быть разрешены в медицинской практике в будущем. Можно ли считать такие черты человека, как интеллект или цвет глаз, подходящими для медицинского улучшения? Подобные страхи могут казаться преждевременными, однако есть и другой повод для тревоги: генная инженерия человека может иметь совершенно непредвиденные и необратимые последствия для будущих поколений. Это соображение становится особенно актуальным в свете последних исследований в области генетики, которые показали, что взаимодействия между генами и другими механизмами наследования намного сложнее, чем считалось ранее.
Упомянутые вопросы не ускользнули от внимания ученых. Некоторые соглашаются, что инженерия человека – это минное поле этических проблем, и считают, что любые исследования с использованием CRISPR-Cas9 на человеческих эмбрионах должны быть запрещены. Другие, однако, уверены, что полный мораторий на подобные изыскания будет не только сложен на практике, но и вреден для научного прогресса. Несмотря на такую разницу во взглядах, научное сообщество сходится в том, что лучшее решение – это открытый публичный диалог, что подтверждается многочисленными совещаниями и конференциями, посвящёнными этой теме, по всему миру.
Между тем, CRISPR-Cas9 продолжает развиваться. Фармацевтические компании инвестируют в этот метод ради новых исследований в области дизайна лекарств, так что технические недостатки находят и исправляют – в то время, как ожесточённый патентный спор между основоположниками технологии (Дудна/Шарпентье против Чжана) изживает себя. Однако каким бы ни был исход, головокружительный взлёт CRISPR-Cas9 – это только начало.
References
-
Cong L et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science339: 819–23. doi: 10.1126/science.123 Cyranoski D, Reardon S (2015) Chinese scientists genetically modify human embryos.Nature 22 April, doi:10.1038/nature.2015.17378
Resources
- Узнайте больше о возможных применениях CRISPR в редактировании РНК.
- Узнайте больше о патентном споре касаемо технологии CRISPR-Cas9.
- Узнайте о том, как технологию CRISPR-Cas9 применяют для лечения миодистрофии Дюшенна.
- Прочитайте о том, как CRISPR-Cas9 используют для выращивания в свиньях органов для пересадки человеку.
- Лёгкая и доступная статья о этических вопросах редактирования генов в половых клетках.
- Статья с комментариями ученых-генетиков из разных стран о этических проблемах редактирования генов в половых клетках:
- Bosley K et al. (2015) CRISPR germline engineering – the community speaks. Nature Biotechnology33: 478–86
Author(s)
Хорас Чан недавно закончил магистратуру по молекулярной и клеточной биологии в университете Гейдельберга (Германия). В данный момент он проходит практику по связям с общественностью в немецком Центре Изучения Рака (DKFZ) в Гейдельберге, а до этого публиковал научные статьи в Asian Scientist, онлайн журнале, посвящённом исследованиям в Азиатско-Тихоокеанском регионе.
Review
CRISPR-Cas9 – это мощный инструмент редактирования генов «с GPS-навигацией». Он способен открыть двери для многих научных, медицинских и сельскохозяйственных применений. Относительная простота и низкая стоимость этого метода поднимает важные этические вопросы. К тому же, они вылились в широко обсуждаемый в СМИ судебный процесс между учеными, сражающимися за ценные патентные права.
Эта статья ясно описывает поиск палиндромных повторов как основной защитный механизм бактерий и его применение в качестве программируемого инструмента редактирования генов CRISPR-Cas9. Её можно использовать вместе с наглядными видеороликами для объяснения молекулярно-биологических основ этого метода, а также причин, почему он заменил прежде существующие способы редактирования генома. Она также может послужить началом дискуссии о этических вопросах генного модифицирования эмбрионов и интеллектуальной собственности. Вопросы на понимание этой статьи могут включать:
CRISPR для чайников, или Краткая справка по быстрому редактированию ДНК
Возможность изменять фрагменты ДНК всегда была святым Граалем биотехнологии и медицины. CRISPR позволяет делать это с невиданной ранее скоростью и эффективностью. Считайте, что биологи раньше работали на пишущей машинке, а благодаря CRISPR в одночасье пересели на MacBook. Не зря открытие этого метода в 2020 году удостоилось Нобелевской премии по химии.
Резка молекулы ДНК с помощью CRISPR-Cas9 (рис. Джанет Иваса)
Под катом — рассказ о появлении CRISPR, принципах работы и применении в настоящем и будущем. Да, вы все верно поняли, это про редактирование коров, синюю клубнику и арбузы размером со сливу с Aliexpress.
Эта статья — переработанная версия лекции Бориса Климовича, научного сотрудника Университетской клиники Тюбингена и Немецкого центра исследований рака (DKFZ), которая прошла в конце ноября при поддержке Точки кипения ЯрГУ.
Признание к CRISPR пришло в 2012 году — после публикации нобелевской работы. Но, как это обычно бывает в науке, открытие — не личная заслуга пары авторов. В этот раз участников событий было много, и началось все вовсе не с генетики.
Все началось с «грязекопателя»
Аббревиатура CRISPR появилась в конце 80-х в ходе исследований солончаков рядом с испанским городом Аликанте. Аспирант Франсиско Мохика изучал архебактерий, живущих в соленой воде, и наткнулся на странные палиндромные последовательности в их геноме.
Фрагменты длиной около 30 нуклеотидов повторялись много раз и отделялись друг от друга уникальными участками ДНК примерно такой же длины.
Упрощенно обнаруженная структура выглядела так:
На тот момент никто не понимал, зачем нужны эти структуры. Сошлись на том, что они необходимы для некой регуляции (стандартное «объяснение» в биологии, когда ничего не понятно). Структурам сначала дали название SRSR (Short Regularly Spaced Repeats), а потом переименовали в CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats).
Продолжив работу в том же направлении, Мохика нашел похожие повторы у многих других бактерий. И эта закономерность привлекла внимание.
В 2002 году рядом с CRISPR-массивами у всех бактерий выявили похожие на них структуры — группу белок-кодирующих генов, которую назвали «очень оригинально» — CAS (CRISPR-Associated Genes).
Продвинуться дальше помог своего рода «генетический Google»: GenBank, куда ученые складируют все прочитанные последовательности ДНК. К началу 2000-х годов там накопилось уже достаточно информации, чтобы при помощи алгоритмов BLAST найти, в каких организмах встречаются похожие CRISPR-последовательности.
GenBank — открытая аннотированная база генетической информации. На июнь 2019 года в ней содержалась информация о 329 млрд пар оснований и 213 млн последовательностей. Источник — American Health Information Management Association
Поиск выявил интересную вещь: фрагменты CRISPR встречаются в ДНК бактериофагов — вирусов, которые инфицируют бактерии и убивают их. Получается, что бактерии хранят внутри себя фрагменты ДНК своих злейших врагов.
Так возникла ключевая догадка о том, что CRISPR — это иммунная память бактерий, сохраняющих информацию о вирусах, которыми болели.
Сформулировав эту теорию, Мохика сел писать статью, которую отправил в самый престижный биологический журнал — Nature. Статью отклонили. Затем он пытался ее пристроить в четыре других журнала, но успеха добился лишь через 18 месяцев.
Кстати, в этом он далеко не рекордсмен. В свое время работу Линн Маргулис, предложившую популярную нынче гипотезу симбиогенеза, отклоняли 15 раз! Можно сказать, что Мохика повезло. Его работу опубликовали быстрее, а идея нашла своих сторонников.
Основная функция CRISPR
Следующий шаг в развитии технологии сделал микробиолог Филипп Хорват. В своей докторской работе он исследовал закваски к эльзасской квашеной капусте, а если точнее — молочнокислые бактерии, которые ее квасят.
С появлением CRISPR закваска капусты стала беспроблемным делом (нет, саму капусту не трогали)
После докторской он ушел в молочную промышленность, где столкнулся с проблемой бактериофагов. Они сильно вредили заквасочным культурам, производители молочных продуктов несли огромные убытки. Ховарт искал способы сделать закваски устойчивыми к бактериофагам и наткнулся на работы о CRISPR. Исследуя эту тему, он доказал, что устойчивые к вирусам бактерии перенимают часть их ДНК.
Бактериальная клетка, которая перенесла инфекцию бактериофагом и не умерла, нарезает его геном на мелкую «вермишель», встраивает в CRISPR-массивы и передает эту информацию своим потомкам, которые становятся устойчивыми к бактериофагу.
Позже компанию, в которой работал Хорват, купила корпорация DuPont. А поскольку она производит примерно 40% заквасок для современной молочной промышленности, вы практически наверняка сталкивались с CRISPR в составе йогуртов, пиццы или сыра.
Работы Хорвата показали, что CRISPR-массивы — это действительно иммунная система бактерий.
Это работает так: кусочки ДНК бактериофагов сохраняются в ДНК бактерий в виде CRISPR-массивов. Затем они превращаются в РНК. В этом же куске генома у бактерий кодируется так называемая тракр-РНК (tracrRNA). Вместе они формируют guideRNA, или наводящую РНК, которая затем объединяется с белком Cas9.
Cas9 — это нуклеаза, фермент, который умеет резать ДНК. При помощи guideRNA этот фермент наводится на специфический сегмент в ДНК бактериофага, садится на него и разрезает, как ножницами, чем нарушает размножение вируса.Нобелевская статья по редактированию генов
Когда две замечательные женщины-ученые Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна встретились на конференции в Коста-Рике, предназначение CRISPR уже было известно. Им пришла в голову смелая идея: приспособить эту систему для резки любой ДНК. Они объединили силы своих лабораторий и в 2012 году в журнале Science опубликовали результаты работы.
Иллюстрация из оригинальной статьи
Им удалось объединить две РНК в одну single guide RNA и показать, что механизм резки работает.
Тут надо пояснить, что резка — это и есть основной этап редактирования ДНК. А CRISPR — генетические ножницы. Все детали ниже.
За эту работу в 2020 году они получили Нобелевскую премию по химии.
Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна
Это событие уникально по двум параметрам.
Во-первых, это первая премия, которую получили две женщины без сопровождающей мужской компании.
Во-вторых, эта премия очень «быстрая». С момента публикации до ее присуждения прошло всего восемь лет.Влияние технологии CRISPR проще всего проиллюстрировать, показав частоту упоминаний этой аббревиатуры в научной литературе, которая после 2012 года растет как на дрожжах.
Число упоминаний CRISPR в научной литературе
Второй показатель — количество патентов.
Эта статистика показывает, насколько все изменилось. Технологии редактирования генома предлагались и ранее, но ни одна из них не достигла такого успеха.
Как происходит редактирование ДНК
Первая нобелевская статья демонстрировала редактирование ДНК в пробирке. Перед учеными стояла амбициозная задача — повторить процесс в клетках человека. Фэн Чжан из MIT оптимизировал процесс, сделав его совместимым с живыми клетками, у которых есть ядра.
Фэн Чжан перенес технологию из пробирки в живые клетки
В 2013 году после публикации работы Чжана эта тема стала доминирующей. Появились сообщения о том, что отредактировали геном человека, мыши, дрожжей, ниматод, дрозофилы, резуховидки Таля, рыбки данио-рерио — всех имеющихся у биологов модельных объектов.
Важно понимать, что ДНК — это очень стабильная молекула. Ее можно кипятить или оставлять лежать в земле на сотни тысяч лет.
Самая старая секвенированная ДНК на сегодняшний день имеет возраст 1,7 млн лет.
Однако молекула ДНК очень чувствительна к разрывам. Если это случается, клетка запускает процесс починки ДНК. Он может идти двумя путями:
Не гомологичный вариант — когда место разрыва устраняется с дефектами. В результате в ДНК может появиться маленькая вставка или произойти потеря фрагмента. Генетический код — это типлеты, то есть три нуклеотида кодируют одну аминокислоту. Если вы вырезали два или вставили четыре нуклеотида, нарушится последовательность, кодирующая белок. Возникнет сдвиг рамки считывания, в результате которого ген фактически перестанет выполнять свою функцию, так как клетка не сможет использовать его информацию, чтобы синтезировать функциональный белок.
Сломать ген можно было и раньше, просто это довольно трудоемко: надо облучать гены радиацией, месяцами искать мутации. Благодаря CRISPR процесс стал гораздо проще.
Гомологичная рекомбинация. У всех животных в клетках как минимум две копии каждой хромосомы. Если возникает разрыв, клетка может использовать вторую хромосому и на ее основании достроить поврежденный участок — скопировать его в поврежденную хромосому. В этой ситуации клетку можно обмануть и подсунуть ей вместо второй хромосомы похожий фрагмент ДНК, но с мутацией. Тогда клетка починит разрыв, встроив в него то, что мы подсунули, — так называемую матрицу.
За счет прицельно вносимого разрыва, который делает CRISPR, появилась возможность очень просто и эффективно заменять фрагменты в геноме — вносить строго определенные мутации и чинить сломанные гены. Но есть проблема: репарация чаще всего проходит по не гомологичному пути. Существуют разные методы, позволяющие сдвинуть процесс в сторону гомологичной репликации, но пока они работают не очень хорошо.
Левая ветвь — не гомологичный вариант замены, приводящий к разрушению гена, правая — успешная починка подходящим фрагментом
Технологии редактирования генома существовали и ранее. Но они требовали сборки так называемых кастомных белков — под заказ. Для каждой операции нужно было собирать новый белок. Это занимало несколько недель и даже месяцев. Стоил каждый такой белок несколько тысяч евро. А CRISPR-реагенты стоят 10‒20 евро — в сотни раз меньше. Стало возможным проводить эксперименты гораздо быстрее и в огромных масштабах. Если вам в воскресенье пришла хорошая идея, то через неделю у вас уже будет клеточная линия с готовой мутацией, — и идею можно будет проверить.
Естественно, это подтолкнуло развитие биотехнологий и промышленности. Появились тысячи компаний, которые пытаются коммерциализировать CRISPR. Параллельно идет патентная война между MIT и Университетом Беркли, где работает Дженнифер Даудна.
Применение CRISPR-Cas9
Что можно сделать с помощью CRISPR? Можно сломать, починить, заменить практически любой ген в геноме. Факт: биологи любят ломать гены, чтобы выяснить, как они работают.
Можно сделать хромосомную перестройку. Это очень важно в онкологии, где ряд заболеваний вызывают хромосомные перестройки.
На следующем этапе технологию улучшили, лишив Cas-нуклеазу активности — сделали ее не режущей. Одновременно «пристегнули» к ней другие ферменты. В итоге она просто садится на строго определенный фрагмент ДНК и может его редактировать, не вызывая повреждений. Например, менять азотистые основания без внесения разрывов в ДНК, что очень важно для биомедицинских задач.
Ученые уже научились активировать или репрессировать работу гена — редактировать эпигеном. Известно, что некоторые гены в организме метилированные, кроме того, существуют специальные белки — гистоны, которые связаны с ДНК. Все это определяет, как ведет себя клетка. CRISPR позволяет влиять и на это.
При помощи CRISPR можно производить высокоточную микроскопию участков генома. Это создает огромные возможности для изучения и настоящий взрыв технологий, который до 2012 года невозможно было себе представить.
Редактируем коров, собак и помидоры
Для чего еще используется подобное редактирование? Например, пятна у породы коров сделали из черно-белых серо-белыми. Считается, что так они лучше переносят жару.
Собакам породы бигль добавили мышц. Практический смысл этой, несомненно, большой работы мне неясен. Но работу выполняли китайцы. Возможно, у них свое представление о прекрасном.
Человеческих органов для пересадки всегда не хватает, поэтому пересаживают органы свиней. Но тут есть проблема: у них в геноме присутствует много спящих ретровирусов, которые после пересадки могут активироваться и угрожать здоровью пациента. У свинок на фото эти фрагменты в геноме инактивировали.
Еще пример: с помощью CRISPR отредактировали количество ветвлений на томатной ветке. А также размеры плодов. Все это на фото выше.
Отредактированных растений уже очень много. О масштабах можно судить по количеству публикаций в научных журналах.
Теперь вы знаете, откуда на Aliexpress семена синей клубники, черных помидоров и арбузов размером со сливу
Но в магазинах (по крайней мере в Европе) CRISPR-модифицированных продуктов нет. Это связано исключительно с осторожностью регулятора, на мой взгляд, излишней.
Раньше генетически модифицированные продукты в Европе запрещали, потому что не знали, что произойдет, если эти модифицированные растения попадут в дикую природу. Может быть, если генно-модифицированная кукуруза «ворвется» в леса, там вымрут все березы. Также не знали, как они повлияют на здоровье человека в долгосрочной перспективе, потому что при модификации использовали генетические элементы из других организмов.
CRISPR позволяет вносить мутации, не оставляя следов, поскольку внедряемые РНК и белок в клетке деградируют. От них ничего не остается, сохраняется только сама мутация. Фактически CRISPR делает то же самое, что происходит при селекции. Несмотря на это, суперосторожные регуляторы решили, что разрешать CRISPR пока не стоит.
Я, как ученый, считаю, что нужно разрешать, и тогда нас ждет настоящий взрыв технологического развития. С помощью CRISPR мы сможем решить очень многие проблемы, в том числе связанные с глобальным потеплением.
Например, вывести засухоустойчивые или более продуктивные сорта растений, которые позволят использовать меньше пахотных земель, не применять пестициды или удобрения.
CRISPR в биомедицине
Самый волнующий вопрос — применение CRISPR в биомедицинских исследованиях для улучшения жизни больных людей (а может, и здоровых — в перспективе). Главная сложность тут — в доставке «генетических ножниц» в клетки человека. Допустим, нам нужно починить неработающий ген, который вызывает болезнь. Но чинить его надо в целом органе или даже во всем теле.
К примеру, мутацию, вызывающую диабет, надо чинить во всей поджелудочной железе. Это непросто, потому что клетки прекрасно себя защищают от вторжения чужеродной ДНК. Поэтому исследователи начали с тех вещей, которые можно из человека вынуть, отредактировать в пробирке, затем размножить и вернуть обратно, — с костного мозга и крови.
Здесь показано, как с помощью CRISPR лечат бета-талассемию и серповидноклеточную анемию.
Эти болезни вызваны двумя разными мутациями в гене бета-гемоглобина.
Больным бета-талассемией нужны частые переливания крови. У больных серповидноклеточной анемией эритроциты забивают сосуды. Качество жизни у них низкое, и есть риск ранней смерти.
Что в такой ситуации позволяет сделать CRISPR? У человека есть третий ген гемоглобина — фетальный гемоглобин, который активен только у эмбрионов до рождения. После рождения он выключается, работают взрослые альфа- и бета-гемоглобины. CRISPR позволяет включить ген фетального гемоглобина — выключив ген, который его контролирует.
У двух больных женщин забрали клетки костного мозга и при помощи вируса внедрили в них CRISPR-конструкцию, которая инактивировала ген BCL11A. В этих клетках заработал фетальный гемоглобин. Правильно отредактированные, отселектированные и размноженные клетки вернули пациентам обратно — пересадили им их же костный мозг. После этого пациентке с бета-талассемией, которой нужно было в среднем 16 переливаний крови в год, в течение года не понадобилось ни одной процедуры. То же произошло и с больной серповидноклеточной анемией — их реально вылечили.
Эти работы перешли на следующую стадию клинических испытаний — в ближайшее время этот метод может войти в повсеместную практику.
Следующее направление работы — терапия ВИЧ. Есть люди, которые не заражаются вирусом иммунодефицита человека за счет мутации в гене CCR5 — делеции в 32 нуклеотида. Если у человека обе копии гена мутированы, вирус просто не может проникнуть в их клетки.
У части пациентов на фоне ВИЧ развивается лимфобластный лейкоз (рак крови). Если другие методы терапии не помогают, больным лимфобластным лейкозом часто пересаживают костный мозг. В этом случае взяли костный мозг у донора, который подходил для лечения лейкемии.
Перед пересадкой клетки отредактировали с помощью CRISPR, выключив в них ген CCR5, — повторили мутацию, которая существует в природе. Пересадка вылечила пациента и от лейкоза, и от ВИЧ.
На мой взгляд, это одна из самых ярких демонстраций возможностей CRISPR.
CRISPR и этика
Говоря о ВИЧ, нельзя не вспомнить о самом нашумевшем случае использования CRISPR. Это история 2018 года. Виновник событий — Цзянькуй Хэ, китайский ученый, который провел эксперимент с редактированием человеческих эмбрионов.
За редактирование ДНК человека Цзянькуй Хэ получил три года тюрьмы
Он занимается ЭКО. Получив эмбрионы от пар, где отцы были инфицированы ВИЧ, он попытался с помощью CRISPR выключить в них ген CCR5. В результате эксперимента родилось трое внешне здоровых детей.
Однако произошло лишь частичное редактирование. У одной девочки первая копия гена получилась с 15-нуклеотидной делецией, чего оказалось недостаточно, чтобы ген перестал функционировать. А вторая копия гена — без изменений. В итоге никакой защиты девочка не получила. Со второй девочкой получилось лучше, но ген все равно остался частично функциональным.
Проблема этого эксперимента — в нарушении этических норм и законов. Как выяснилось, Цзянькуй Хэ фальсифицировал разрешение этической комиссии, которая не одобрила это исследование. Во всех странах у нормальных ученых это означает полный запрет, но он его проигнорировал. Кроме того, эксперимент был плохо подготовлен, исследователь не взвесил возможные риски. Редактирование толком не получилось, а последствия этих экспериментов могут проявить себя позже. CRISPR не обладает стопроцентной точностью, он может вносить мутации где-то еще в геноме. И где он их внесет, предсказать сложно.
Если бы все дети с ВИЧ умирали, это меняло бы дело. Но с современными препаратами ВИЧ-инфицированные матери рожают ВИЧ-негативных детей более чем в 90% случаев. Поэтому эксперимент был еще и бессмысленный.
Ни один ученый в мире не сомневался, что технически метод CRISPR позволяет редактировать эмбрионы, то есть научной новизны в этом эксперименте тоже не было. Но это надо было делать с соблюдением всех норм и другим уровнем подготовки. А главное, технология еще недостаточно созрела, чтобы со стопроцентной гарантией отредактировать только нужное место в геноме и ничего не сломать в остальных.
Гражданин Хэ подорвал веру в ученых, получив вал критики, почти полмиллиона долларов штрафа и три года лишения свободы.
Я думаю, до широкой практики редактирования человеческих эмбрионов нам далеко. Но, безусловно, когда-то мы к этому придем, и при помощи CRISPR будут лечить тяжелые наследственные заболевания.
Кому сейчас доступен CRISPR
Поработать с CRISPR могут «не только лишь все»©. В интернете за небольшие деньги можно купить набор, где есть все необходимое.
Некоторые экспериментируют прямо на собственной кухне
Если у вас есть мало-мальски оборудованная лаборатория для простейших молекулярно-биологических экспериментов, начать работать с CRISPR будет легко. И это действительно фантастический инструмент, который невероятно ускорил прогресс биомедицинской науки.
Вся эта история учит нас тому, что даже ковыряясь — буквально — в грязи, можно сделать невероятные открытия. Ну и еще тому, что наука интернациональна.
Нет никакой российской науки, немецкой науки, есть интернациональная наука.
Та же Эммануэль Шарпантье работала сначала в Нью-Йорке, потом в Мемфисе, в Вене, в Швеции, в Ганновере, а прямо сейчас работает в Берлине. Поэтому задача ученого — знать хотя бы один международный язык и пытаться развивать собственную мобильность — двигаться, искать связи и сотрудников, новых коллег. Шарпантье и Даудна встретились на конференции, заинтересовались общей проблемой и в итоге получили Нобелевскую премию. Кто знает, как бы сложилась история CRISPR, не будь этой встречи.
Что такое технология редактирования генома CRISPR-CaS9 и почему она стала такой спорной?
Технология редактирования генов, возможно, является самой быстроразвивающейся отраслью науки в 21 веке. Изобретение метода CRISPR-Cas9 положило начало революции в области изменения генов, поскольку он дешевле и эффективнее предыдущих методов. Основатели получили Нобелевскую премию по химии 2020 года, тем не менее, существует много споров по поводу этических проблем генетических манипуляций.
CRISPR-Cas в природе
Защита ДНК у прокариот
CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) — это семейство систем ДНК бактерий и архей в естественном мире. Он играет важную роль в иммунной системе организмов. Механизм довольно простой. Фрагменты ДНК CRISPR берутся из генома (полный набор генетических инструкций организма. Каждый геном содержит всю информацию, необходимую для построения этого организма и обеспечения его роста и развития) вируса, инфицировавшего бактерии-бактериофаг. Клетка использует их для идентификации и уничтожения бактериофага, если он снова попытается заразить организм. Более того, бактерии могут передавать гены друг другу, так что клетки могут передавать информацию о вирусе от одного к другому.
Фермент Cas9
Cas9 — это фермент, который использует информацию CRISPR в качестве уведомления. Он использует данные последовательностей для поиска фрагментов ДНК, которые «подходят» к последовательности CRISPR. Это означает, что CRISPR имеет последовательность, которая образует пары с ДНК вируса. Когда две последовательности «совпадают», мы называем их взаимодополняющими.
Визуализация системы CRISPR-Cas
Система CRISPR-Cas9
Наконец, CRISPR и фермент Cas9 создают мощный инструмент иммунной системы, известный как CRISPR-Cas9. Он широко распространен среди бактерий — мы можем найти его более чем в половине всех геномов и 90% геномов архей. Это основная система защиты клетки от бактериофагов, что делает ее необходимой для жизни и эволюции бактерий. Как тогда этот механизм используется при редактировании генов?
Механизм редактирования генома с помощью CRISPR
Молекулярные ножницы
Технология CRISPR-Cas9 позволяет ученым удалять, изменять или добавлять участки ДНК. Белок Cas9 действует как молекулярные ножницы. Он разрезает нити ДНК в определенном месте, позволяя внести изменения. Затем направляющая РНК (гРНК), состоящая из небольшого кусочка специально разработанного фрагмента РНК CRISPR в более расширенной последовательности. Более длинная часть связывается с матричной ДНК, тогда как CRISPR направляет Cas9 в нужное место в геноме, точно так же, как это происходит у бактерий и архей.
Часть CRISPR является комплементарной только для одной области генома, поэтому она не будет связываться где-либо еще, что делает технологию точной. Когда Cas9 находит комплементарный фрагмент, он разрезает ДНК. Клетка распознает разрез как повреждение и восстанавливает его, комбинируя мутацию (более крупный кусок) со своей ДНК. В результате получается функционирующий геном с определенной мутацией.
Применение технологии CRISPR-Cas9
ДНК содержит гены — подробную информацию о белках и их создании. Генетическая экспрессия — это когда определенные структуры транслируют информацию, позволяя создавать различные молекулы. В совокупности информация в ДНК и факторы, влияющие на экспрессию, создают нас. ДНК состоит из информации о каждом отдельном белке, из которого мы построены — его структуре, местонахождении, способах экспрессии, функциях и многом другом. Следовательно, изменение ДНК изменяет организм на молекулярном уровне. Это делает CRISPR-Cas9 таким мощным инструментом. Используя правильные последовательности, мы можем изменить образ жизни организмов и настроить их в соответствии с нашими потребностями. Конечно, существуют проблемы, связанные с тем, какие гены использовать, куда их вставить и как они повлияют на организмы.
Нобелевская премия 2020 и споры
Нобелевская премия 2020
Нобелевская премия по химии 2020 года была присуждена Эммануэль Мари Шарпантье и Дженнифер Даудна — пионерам метода CRISPR-Cas9. Шарпантье — французский профессор, микробиологический исследователь и основатель независимого исследовательского института имени Макса Планка по науке о патогенах. Дженнифер Даудна — профессор химии в Университете Беркли, Калифорния. Она также является исследователем в медицинском институте Говарда Хьюза. Их награда — первая научная Нобелевская премия, полученная двумя женщинами.
Основатели метода CRISPR-Cas9 были удостоены Нобелевской премии 2020 г.
Полемика
Эти две женщины не единственные, кто заявляет, что они изобрели этот метод. Команда из Массачусетского технологического института утверждает, что открыла его самостоятельно. Две команды теперь судятся друг с другом за права на патент. Все сводится к тому, кто первым изобрел метод CRISPR-Cas9.
Технология редактирования генов — одна из самых многообещающих и одна из самых противоречивых в современной науке. Люди боятся «играть в бога», манипулировать детскими геномами или создавать новые превосходные виды. Хотя это, безусловно, сопряжено с большой ответственностью и возможной угрозой, это также может значительно улучшить нашу жизнь и понимание мира. «Ничего в жизни не следует бояться; это нужно только понять«, — сказала Мария Кюри. С этой мыслью мы должны использовать CRISPR-Cas9, чтобы сделать мир лучше, понимая риски и ответственность, связанные с властью.